CRISPR是一个不断突破现有认知的技术工具，不仅可以实现基因敲除/突变/敲入，现在它还可以做基因过表达/基因沉默/基因调控等，接下来就听Cas9X™为您仔细介绍一下这位“斜杆青年”。
在生物学研究中，CRISPR-gRNA文库是一种高通量筛选靶基因的工具，可大规模或全基因组进行功能筛选，涉及信号通路、疾病、细胞药物应答、发育、基因调控等方面，高分的研究成果层出不穷。海星生物在gRNA文库筛选方面积累了丰富的经验，能够帮助客户快速应用最新的技术构建CRISPR KO（基因敲除）、CRISPRa（基因激活）文库、CRISPRi（基因抑制/沉默），并提供全套的细胞功能筛选服务，涵括文库构建、病毒文库、细胞转染和筛选、NGS测序与数据分析服务。下面就和我们一起仔细了解这些新的应用技术吧！
CRISPR-gRNA文库构建技术流程
CRISPRa（基因激活）系统是用于激活内源性基因转录的强大工具，切割失活的Cas9（dCas9）连上转录激活子（如VP64、p65和HSF1），可以有效促进基因组特定位点的转录。研究显示，CRISPRa技术可以使得基因的转录得到了两倍到数千倍的增长，许多基因的活性甚至有了几个数量级的增加。
服务的内容：客户提供相关的需要激活表达的基因信息，海星生物将按照基因的生物信息特点，设计gRNA、构建载体、包装病毒通过病毒转染到目的细胞，筛选出激高表达或者合适的gRNA序列，并构建成CRISPRa稳转细胞株，并使用Q-PCR对目的基因表达量进行检测，并依据客户的需求提供单克隆建立和表型的筛选服务。
服务优势：通过内源基因组背景进行激活，激活表达量可以从2倍到几个数量级的提升。
CRISPRa vs ORF过表达
RISPRi （基因抑制/沉默）系统是用于抑制内源性基因转录的强大工具，当dCas9（没有切割活性的Cas9）被引导到靶基因的转录起始位点TSS（transcription start site）时，dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过，导致基因沉默。同时dCas9融合了一个基因抑制结构域，如KRAB结构域，这样的蛋白称之为dCas9-KRAB，可以进一步提高转录抑制的效率。此外，dCas9也可以融合双抑制结构域KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。
由于dCas9-KRAB CRISPRi系统是在DNA水平抑制基因表达，因此适用于多种类型的基因，包括：mRNA、非编码RNA、microRNA、反义转录本、核定位RNA以及聚合酶III 转录本等基因的转录抑制。
CRISPRi显著的转录抑制效果
服务内容：
客户只需要提供要进行敲减的基因和转录本信息，将有海星生物设计gRNA序列，构建病毒载体，病毒包装后转染目的细胞，并根据客户的需求进行筛选出符合敲减水平低gRNA，并提供CRISPRi稳转细胞株的构建和单克隆的扩增筛选的服务。
技术优势：
不改变内源基因组背景、基因抑制效果可筛选、适用更多基因种类。
RNAi vs CRISPRi
研究基因功能最常见的方法是，减少或者阻断基因表达，然后进行表型分析。RNAi和CRISPRi都是常用的基因表达水平敲低的研究工具。
RNA干扰（RNAi）靶向细胞质中成熟的RNA，而CRISPRi则在细胞核内阻止转录的起始，因而敲低效果更为显著。此外RNAi的脱靶效应要远远高于CRISPRi。
CRISPRi的敲低效果显著优于RNA
作者：海星生物 公众号：Cas9X细胞基因编辑
以上内容由海星生物（www.cas9x.com)提供
在生物科学领域，基因沉默现象引起了科研人员极大的兴趣。基因沉默，顾名思义，是指通过特定手段使基因失去活性或降低其表达水平的过程。这一现象在生物体内普遍存在，对于维持生命活动的稳定以及应对各种环境变化具有重要意义。本文将详细介绍基因沉默的概念、常用技术和实验步骤，展望其应用前景，以期帮助读者更好地理解这一现象。
一、基因沉默的概念
基因沉默主要指基因表达的抑制和沉默现象。在生物体内，基因的表达受到严格调控，而基因沉默就是一种重要的基因表达调控方式。根据作用方式的不同，基因沉默可分为自然发生的基因沉默和人为操作的基因沉默。自然发生的基因沉默可通过多种因素实现，如DNA甲基化、异染色质形成、转录后基因沉默（RNAi）等。而人为操作的基因沉默则可以通过基因敲除、转录因子抑制、表观遗传修饰等方法实现。
二、常用基因沉默技术
RNA干扰（RNAi）：RNAi技术利用双链RNA（dsRNA）引发特异性mRNA的降解，从而降低或关闭目标基因的表达。RNAi技术具有高效、特异性强、操作简单等优点，已成为研究基因功能和药物筛选的重要工具。然而，该技术也存在一定的脱靶效应和细胞毒性等问题。
化学沉默：化学沉默是指通过特定的化学抑制剂或药物作用于细胞，干扰基因的表达或转录过程，从而实现基因沉默。常用的化学沉默药物包括DNA甲基化抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂等。这类方法的优点是可以通过口服或注射给药，直接作用于患者体液或组织，但对于作用机制和药物剂量要求较高。
基因敲除：基因敲除技术通过同源重组或CRISPR-Cas9等手段，将目标基因进行部分或完全敲除。该技术具有较高的特异性和可操作性，但需要设计特异性的核酸酶，且存在一定的细胞毒性风险。
三、RNA干扰（RNAi）基因沉默技术的基本步骤
寻找目的基因：确定想要沉默的目标基因，可以通过文献研究、基因表达谱分析等方法来筛选。
设计并合成siRNA：根据目标基因的序列，设计并合成能与目标基因特异结合的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）。shRNA在细胞内被转录和表达后，会形成约21-23bp的siRNA。
转录和表达shRNA：将设计好的shRNA通过转染或者其他方式转入到细胞中，并在细胞内转录和表达shRNA。
siRNA与目标基因结合：转录后形成的siRNA在细胞内与目标基因结合，抑制目标基因的表达。这一过程需要RNA解旋酶将siRNA双链解开，反义链与RNA诱导沉默复合物RISC形成复合物，最终由siRNA互补结合靶RNA引导核酸酶切割，实现转录后水平的基因沉默。
验证基因沉默效果：通过qRT-PCR、Western Blot等技术检测目标基因的表达水平，评估基因沉默效果。
这些步骤是RNAi基因沉默技术的基本流程，具体操作可能因实验室和研究需求而有所不同。
PS：shRNA和siRNA在RNAi过程中具有密切关系。它们都是具有一定结构特点的RNA序列，在RNAi通路中发挥关键作用。
siRNA是RNA干扰过程中触发基因沉默的主要分子。在RNAi通路中，siRNA通过与互补mRNA分子杂交干扰基因表达。这种干扰会导致mRNA降解，进而抑制特定基因的表达。
shRNA是siRNA的前体，由短发夹RNA（short hairpin RNA）加工而来。shRNA的结构由互补的两条序列及loop环组成。在形成siRNA的过程中，shRNA会被Dicer酶切割，生成21-23bp的siRNA。然后，siRNA会装载到RISC复合物上，并与与其序列同源的靶mRNA结合，引导RISC复合物切割靶mRNA，从而触发基因沉默。
总之，shRNA和siRNA在RNAi过程中具有密切关系，shRNA经过加工生成siRNA，后者是触发基因沉默的关键分子。
四、基因沉默RNAi试剂推荐
1. Dharmacon可提供的siRNA产品类型
1）ON-TARGETplus™ siRNA——全新的基因沉默标准，显著降低脱靶效应基因沉默中最主要的脱靶效应是由反义链中“seed region”活性引起的，一味地提高反义链的活性可能增加由反义链引起的脱靶。ON-TARGETplus ™在SMARTselection技术基础上结合最新的功能性和特异性设计原则，并利用独—无二的双链修饰技术——结合正义链失活技术和反义链seed region 修饰技术，同时减少由双链引起的脱靶效应，使得ON-TARGETplus™ siRNA的脱靶效应降到最低。
图注：ON-TARGETplus™修饰减少了脱靶效应，而SMARTpool进一步减少了脱靶的数量
2）siGENOME™ siRNA——经济、可信的基因沉默工具siGENOME™合理分析链偏好性，选择合适靶点，同时选择性使用ON-TARGET™技术保证沉默效率和低脱靶率。
3）Accell™ siRNA—史无前例的新武器，无需任何转染试剂
极简的操作方法：无需转染试剂、电转仪器或病毒载体即可完成高效siRNA投递创新的siRNA修饰专利方法，同时拥有高摄取率、高稳定性、高特异性和高沉默效率已在神经细胞、免疫细胞、原代细胞等难转染的细胞中成功应用特殊的稳定性修饰，可直接应用于体内转染低细胞毒性，可对细胞持续使用，延长靶基因的沉默持续时间图注：Accell™ siRNA 操作步骤
2. Dharmacon可提供的shRNA产品类型
1）GIPZ™慢病毒载体shRNA——模拟microRNA设计的shRNA，高效低毒，保证沉默效率
Dharmacon针对人和小鼠的每个基因分别设计了多条shRNA，从而保证沉默效率TurboGFP报告基因和shRNA受同—启动子启动表达，监测shRNA表达效果可用于转导原代细胞或非分裂细提供甘油菌克隆及克隆set，可利用puromycin筛选稳定细胞株GIPZ shRNA质粒载体元件示意图
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它的特点就是善于捕捉到非常细微的特点它的特点就是善于捕捉到非常细微的特点
为了更加确定自己做的沉默或者过表达是有作用的啊,发表文章更有说服力
[最佳回答]B本题关键是抓住信息“基因沉默”,所以影响的是基因的表达。
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